Tausende Arbeiter waren den beiden Hauptfeinden, Gelbfieber und Malaria, zum Opfer gefallen. Insgesamt wurde der Kanalbau mit geschätzten 25.000 Menschenleben bezahlt.

Mit der technischen Leitung des Mammutprojekts wurde der Ingenieur und Oberst George Washington Goethals betraut, während der Militärarzt Oberst William Crawford Gorgas den Kriegszug gegen die Moskitos anführte. Er ließ Entwässerungsgräben bauen, um stehende Gewässer trocken zu legen. Verbleibende Pfützen und Tümpel wurden mit Petroleum begossen, um den Lebensraum der Moskitos zu zerstören. Gebäude wurden mit Fliegengittern versehen und die Kanalzone erhielt ein modernes Wasser- und Abwassersystem. Als Goethals Gorgas vorrechnete, dass jeder Moskito, der im Rahmen der umfangreichen Maßnahmen getötet würde, die US-Regierung 10 Dollar kostete, soll Gorgas entgegnet haben: „Und was ist, wenn einer dieser 10-Dollar-Moskitos Sie sticht?“ Die attraktiveren Arbeits- und Lebensbedingungen erleichterten die Rekrutierung der benötigten Arbeitskräfte.

1913 standen 65.000 Menschen auf den Lohnlisten des Unternehmens.

Die größten Herausforderungen des Kanalbaus waren das Durchschneiden des Culebra-Gebirgszuges, der Bau eines Staudamms am Rio Chagres und schließlich der Bau der drei Doppelschleusen von Gatún, Pedro Miguel und Miraflores. Sie mussten die Schiffe auf das Niveau des Gatún-Sees heben, der sich durch das Aufstauen des Chagres gebildet hatte, und dabei 26 Höhenmeter überwinden.

Am 15.August 1914 durchfuhr die Ancon als erstes Schiff den Kanal.